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技術(shù)突破:珀羅汀實現(xiàn)無細(xì)胞蛋白表達(dá)結(jié)合納米盤超高效率表達(dá)全長膜蛋白

更新時間:2024-11-22      點擊次數(shù):419

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珀羅汀生物膜蛋白表達(dá)平臺取得新突破!


日前,珀羅汀生物通過在自主研發(fā)的無細(xì)胞蛋白表達(dá)(CFPS)系統(tǒng)中添加納米盤(Nanodisc),實現(xiàn)膜蛋白表達(dá)后高效率地直接組裝在納米盤中!


珀羅汀擁有全部自主知識產(chǎn)品!


預(yù)計此項技術(shù)將大大提升國內(nèi)膜蛋白研究、研發(fā)的整體效率!

膜蛋白表達(dá)新選擇


膜蛋白在細(xì)胞的許多生命活動中發(fā)揮著重要作用,例如物質(zhì)跨膜運輸、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。由于膜蛋白存在疏水性的跨膜結(jié)構(gòu)域(TMD),重組膜蛋白表達(dá)往往存在表達(dá)量低、構(gòu)象不穩(wěn)定的難點。

無細(xì)胞蛋白表達(dá)(CFPS)是一種體外直接合成蛋白質(zhì)的生物反應(yīng)。該技術(shù)將細(xì)胞內(nèi)合成蛋白所需要的RNA聚合酶、核糖體及轉(zhuǎn)錄翻譯輔助因子等分子機器提取出來,并輔以核苷酸、氨基酸、能量物質(zhì)及基因模板,在沒有活細(xì)胞參與的體外合成蛋白質(zhì)。

CFPS可控性、開放性高,可以在體系中直接添加去垢劑或納米盤,為膜蛋白提供類膜環(huán)境,從而實現(xiàn)全長膜蛋白可溶性表達(dá)。

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圖1 無細(xì)胞體系表達(dá)膜蛋白[1]

無細(xì)胞表達(dá)偶聯(lián)納米盤組裝新突破


近日,珀羅汀生物在自研無細(xì)胞體系中加入Nanodisc,成功表達(dá)了某融合綠色熒光蛋白(GFP)的膜蛋白,并驗證了該膜蛋白成功組裝進納米盤。如圖2所示,該膜蛋白在無去垢劑與納米盤的CFPS體系中沉淀表達(dá),而添加表面活性劑或納米盤后均可實現(xiàn)可溶表達(dá),且添加納米盤時表達(dá)情況優(yōu)于去垢劑組。


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圖2 CFPS+Nanodisc表達(dá)情況


本實驗所用膜支架蛋白(MSP)帶有His純化標(biāo)簽,而融合GFP的膜蛋白無His純化標(biāo)簽。如圖3所示,經(jīng)鎳珠親和純化后,膠圖有明顯目標(biāo)膜蛋白條帶,表明通過MSP的His標(biāo)簽純化到了目標(biāo)膜蛋白,即目標(biāo)膜蛋白成功組裝在納米盤中!

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圖3 CFPS+Nanodisc組裝情況


膜蛋白的“搖籃"


納米盤(Nanodisc)是由膜支架蛋白(MSP)和磷脂分子組成的圓盤狀類膜結(jié)構(gòu),能夠為膜蛋白提供穩(wěn)定、接近天然的膜環(huán)境。


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圖4 Nanodisc結(jié)構(gòu)示意圖[2]


Nanodisc體系的顯著優(yōu)勢在于:

①Nanodisc能夠提供與天然細(xì)胞膜更接近的磷脂雙分子層環(huán)境,有利于膜蛋白形成正確的天然構(gòu)象

②Nanodisc更有利于維持膜蛋白構(gòu)象穩(wěn)定,有利于下游純化;

③組裝在Nanodisc中的膜蛋白更有利于下游研究,可直接進行ELISA檢測,可應(yīng)用于結(jié)構(gòu)生物學(xué),適用于NMR、EPR等各種技術(shù);

④通過靈活使用不同長度的膜支架蛋白,Nanodisc可以適應(yīng)不同尺寸的膜蛋白。

無細(xì)胞體系允許膜蛋白表達(dá)與組裝進Nanodisc同時進行。珀羅汀生物通過在無細(xì)胞體系中直接加入Nanodisc,已實現(xiàn)表達(dá)出的膜蛋白直接組裝在納米盤中。與基于細(xì)胞系統(tǒng)的Nanodisc平臺相比,無細(xì)胞表達(dá)偶聯(lián)Nanodisc組裝的方案避免了在表達(dá)后用去垢劑溶解膜蛋白的額外流程,減少了對膜蛋白構(gòu)象的影響,大大降低了膜蛋白純化難度。

從此,對于中國生命科學(xué)研究者而言,膜蛋白表達(dá)不再被卡脖子!

參考文獻


[1] Manzer ZA, Selivanovitch E, Ostwalt AR, Daniel S. Membrane protein synthesis: no cells required. Trends Biochem Sci. 2023 Jul;48(7):642-654. doi: 10.1016/j.tibs.2023.03.006. Epub 2023 Apr 20. PMID: 37087310.

[2] Gulezian E, Crivello C, Bednenko J, Zafra C, Zhang Y, Colussi P, Hussain S. Membrane protein production and formulation for drug discovery. Trends Pharmacol Sci. 2021 Aug;42(8):657-674. doi: 10.1016/j.tips.2021.05.006. PMID: 34270922.



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